Действие игры разворачивается на территории Италии образца 1476-го года. Альтаир снят с должности главного героя и его место заменил флоренцианский представитель знати Эцио Аудиторе де Фиренце – тоже дальний родственник Десмонда, из генов которого выкачивают ценную информацию. Леонардо да Винчи, как и несколько других исторических личностей тех времен (скажем, Николло ло Макиавелли и Катерина Сфорца), будут помогать нашему профессиональному киллеру.